Enhancement of lipase activity from Stenotrophomonas maltophilia by random mutagenesis

• Main Author: Niramol Juntawieng (Author)
• Other Authors: Warawut Chulaluksananukul (Contributor), Alisa S. Vangnai (Contributor), Chulalongkorn University. Faculty of Science (Contributor)
• Format: Book
• Published: Chulalongkorn University, 2013-10-26T04:27:59Z.
• Subjects: Thesis
• Online Access: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/36376
• Other title: การเพิ่มการทำงานของไลเพสจากเชื้อ Stenotrophomonas maltophilia โดยขบวนการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์แบบสุ่ม
• Notes: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/36376
• Keywords: Bacteria; Lipase; Mutagenesis; Mutation breeding; Transesterification; แบคทีเรีย; ไลเปส; ฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์; การชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์; ทรานเอสเทอริฟิเคชัน

Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2007

The isolation of lipase-producing bacteria were isolated from sources of 12 soil samples and 10 composts in Thailand, using enrichment media containing olive oil. The primary screening was carried out employing tributyrin agar plate and Rhodamine B supplemented with olive oil was used for secondary lipase screening. Fifty-five lipase-producing isolates were determined lipase activity by using p-nitrophenyl palmitate as substrate. The results showed that Stenotrophomonas maltophilia CU22 exhibited the highest specific activity. Also, lipase from S. maltophilia was catalyzed transesterification of the palm oil and methanol in non-solvent media and showed 7% methyl ester conversion. To improve lipase activity, random mutagensis by UV irradiation was used. At 10 sec expose time, the death rate with 96.67%, 47 mutants was as subject to test hydrolytic assay. Ten mutants with higher lipase specific activity were subcultured twenty times and then investigated transesterification. UV107, UV1016 and UV 1048 showed %conversion higher than wild type, were 7.56, 9.30 and 7.3 %. DNA and amino acid sequencing of partial lipase gene of wild type and UV1016 , were compared. The result showed nucleotide substitution at 1765, 1766 and 1768 with different amino acid substitution, were obtained. There are Asn568->Asp, Gln589->Trp and Arg590->Gly.

จากการคัดเลือกและแยกแบคทีเรียจากตัวอย่างดิน 12 แหล่งและตัวอย่างปุ๋ย 10 แหล่ง โดยนำมาเพิ่มจำนวนเชื้อแบคทีเรียที่สามารถผลิตไลเพสได้ ในอาหารที่มีน้ำมันมะกอกเป็นองค์ประกอบ จากนั้นจึงนำมาคัดเลือกแบคทีเรียที่สามารถผลิตไลเพสขั้นต้นบนอาหารไตรบูไทริน สามารถคัดเเยกเชื้อ แบคทีเรียได้ทั้งหมด 95 ไอโซเลต จึงนำแบคทีเรียที่ได้มาทดสอบอีกครั้งบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งที่มี น้ำมันมะกอก และโรดามีน บีเป็นส่วนผสมอยู่ พบว่ามีแบคทีเรียจำนวน 55 ไอโซเลตสามารถสร้าง ไลเพสได้ จากนั้นนำแบคเรียที่ได้มาเลี้ยงในอาหารเหลวสำหรับการสร้างไลเพสโดยใช้น้ำมันมะกอก เป็นตัวชักนำในการสร้างไลเพส จากนั้นเมื่อทดสอบความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาของไลเพสจากเชื้อ ที่คัดเลือกได้พบว่า Stenotrophomonas maltophilia CU22 สามารถให้ค่าไฮโดรไลติกแอคติวิตี สูงสุดและเปลี่ยน น้ำมันปาล์มให้เป็นเมทิลเอสเทอร์ได้ดีเมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์อื่น จึงนำมาชักนำ ให้เกิดการกลายพันธุ์ โดยใช้รังสี UV พบว่าเมื่อฉายรังสี UV เป็นระยะเวลา 10 วินาทีมีอัตราการตาย 96.67 % ได้พันธุ์กลาย 47 ไอโซเลต และเมื่อทดสอบความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาของไลเพสพบว่า 11 ไอโซเลตสามารถให้แอกทิวิตี จำเพาะสูงขึ้น จึงนำแบคทีเรียทั้ง 11 ไอโซเลตมาตรวจสอบความเสถียร พบว่ามี 10 ไอโซเลตที่ยังคงให้ค่าแอกทิวิตีจำเพาะสูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้นเมื่อทำการเลี่้ยงไปผ่านไป 20 ชั่วรุ่น จึงนำมาทดสอบความสามารถในการผลิตเมทิลเอสเทอร์ด้วยปฏิกิริยาทรานส์เอสเทอริฟิเคชัน พบว่าสายพันธุ์กลาย 3 สายพันธุ์ที่ได้จาการฉายรังสี UV คือ UV107, UV1016 และ UV1048 สามารถเปลี่ยน เป็นผลิตภัณฑ์ได้มากกว่าสายพันธุ์ตั้งต้นโดยให้ร้อยละการเปลี่ยนแปลงเป็นผลิตภัณฑ์ เท่ากับ 7.56, 9.30 และ 7.37% ตามลำดับ ในขณะที่สายพันธุ์ตั้งต้นให้ร้อยละการเปลี่ยนแปลง เป็นผลิตภัณฑ์เท่ากับ 6.91% ดังนั้นสายพันธ์กลาย UV 1016 จึงมีความสามารถให้ร้อยละ การเปลี่ยนแปลงเป็นผลิตภัณฑ์มากกว่าสายพันธุ์ตั้นต้นถึง 35% ซึ่งเมื่อตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ ของยีนไลเพสพบว่ามีการเปลี่ยนแปลง ของลำดับของนิวคลีโอไทด์ตัวที่ 1702, 1765, 1766 และ 1768 ซึ่งทำให้ลำดับของกรดอะมิโนเปลี่ยนแปลงไปด้วยคือตำแหน่งที่ 568 จากแอสปาราจีนเป็น แอสปาติก แอซิด, ตำแหน่งที่ 589 จากกลูตามีนเป็น ทริปโตฟาน และตำแหน่งที่ 590 จากอาร์จินีน เป็นไกลซีน