DSCR1 gene silencing by siRNA in fibroblast cells from patient with down syndrome

• Main Author: Natchamon Sakundejpaiboon (Author)
• Other Authors: Warawut Chulalaksananukul (Contributor), Verayuth Praphanphoj (Contributor), Chulalongkorn University. Faculty of Science (Contributor)
• Format: Book
• Published: Chulalongkorn University, 2014-03-23T04:28:32Z.
• Subjects: Thesis
• Online Access: Connect to this object online.
• Other title: การยับยั้งการแสดงออกของยีนดีเอสซีอาร์วันโดยใช้เอสไออาร์เอ็นเอในเซลล์ไฟโบรบลาสต์จากผู้ป่วยดาวน์ซินโดรม

Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2009

DSCR1 (Down Syndrome Critical Region 1) is overexpressed in fetal Down Syndrome (DS) brain. DSCR1 belongs to highly conserved calcineurin inhibitor family called calcipressin. DSCR1 can bind to and inhibit calcineurn, a protein important for learning and memory. Small interfering RNA (siRNA) molecules are the key intermediaries in post-transcriptional gene silencing which when exogenously administered can inhibit the expression of any given target gene. Since DSCR1 is overexpressed in DS fetal brain, it's possible that normalizing DSCR1 ecpression may restore normal brain function is DS individual. The goal of this study is to inhibit DSCR1 gene in fibroblast cells by siRNA. The comparison result of mRNA (by real time PCR) and protein (by western blot) gene expression between untreated and treated with 3 concentrations of siRNAs in control and case samples indicated that siRNAs did not affect to mRNA level of DSCR1 gene in control samples (t test, Pr=0.61, 0.5626 and 0.3947) due to the long period of post-transfection. The RFP (Red Florescent Protein) gene was cloned into siRNA plasmid vector to indicate the uptake rate and siRNA efficiency. RFP signal was shown that siRNAs were effectively within 5 days of post-transfection but the limitation of cell lines growth could not collect cell within 5 days. The Result of siRNA effect in case samples indicated that siRNA concentration 0.5fold and 1 fold increased DSCR1 mRNA level (t test, Pr=0.0203 and 0.0054). By the way, the result of 1.5 fold of siRNAs in case samples indicated that siRNAs at high concentration could not affect to mRNA

ยีน DSCR1 (Down Syndrome Critical Region 1 gene) เป็นยีนที่มีส่วนเกี่ยวข้องกับการเรียนรู้และการจดจำ โดยในสมองของทารกผู้ป่วยดาว์นซินโดรมจะมีการแสดงออกที่มากเกินปกติ (over-expression) ซึ่ง ยีน DSCR1 ในผู้ป่วยจะ translate เป็นโปรตีน calcipressin ที่มากสามารถยับยั้งการทำงานของโปรตีนที่มีส่วนสำคัญในการเรียนรู้และการจดจำ ที่เรียกว่า calcineurin ได้ ดังนั้นหากยับยั้งการทำงานของ DSCR1 ก็อาจส่งผลให้ผู้ป่วยมีการเรียนรู้และจดจำที่เป็นปกติได้ เทคนิค RNAi (RNA interfering technology) เป็นกระบวนการยับยั้งการทำงานของยีนที่เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ ปัจจุบันจึงได้ถูกนำมาใช้ในการยับยั้งการทำงานของยีนต่าง ๆ โดยกุญแจสำคัญของกระบวนการนี้คือ siRNA (small interference RNA) ซึ่งมีลำดับเบสที่ complementary กับ mRNA ของยีนเป้าหมาย โดยจะเกิดการจับและทำลาย mRNA เป้าหมายนี้ ส่งผลให้ยีนไม่สามารถทำหน้าที่ต่อไปได้ วัตถุประสงค์ของการวิจัยในครั้งนี้ เพื่อศึกษาถึงผลของ siRNA ต่อการยับยั้งการทำงานของยีน DSCR1 ที่มีมากเกินปกติในเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของผู้ป่วย โดยศึกษาการแสดงออกของยีน DSCR1 ในเซลล์ไฟโบรบลาสต์จากคนปกติและผู้ป่วย ทั้งในระดับ mRNA และโปรตีน โดยวิธี real time PCR และ western blot ตามลำดับ และทำการเปรียบเทียบการแสดงออกของยีน คู่กับเซลล์ที่ถูก transfect ด้วย siRNA ในความเข้มข้นที่แตกต่างกัน 3 ระดับ พบว่า ในคนปกติ siRNA ทุกระดับ (t test, Pr=0.61, 0.5626 and 0.3947) ไม่มีผลต่อการแสดงออกของ mRNA จากยีน DSCR1 เนื่องจากระยะเวลาที่นานเกิดไปในการเพาะเลี้ยงเซลล์ในเพียงพอต่อการสกัด mRNA ซึ่งเมื่อติดตามอัตราการรับ siRNA สู่เซลล์ไฟโบรบลาสต์ โดยการติดยีนเรืองแสงของ RFP (Red Fluorescent Protein) เข้ากับ vector ของ siRNA พบว่า siRNA จะอยู่ภายในเซลล์ได้ในภายในระยะ 5 วันเท่านั้น เนื่องด้วยข้อจำดักของเซลล์ไฟโบรบลาสต์ที่มีการเจริญช้า จึงทำให้ไม่สามารถทำการสกัดและวัดปริมาณ mRNA ได้ในระยะเวลา 5 วันได้ ส่วนการทดลองในเซลล์ของผู้ป่วยนั้นพบว่าการแสดงออกของ mRNA ที่การ treat ด้วย siRNA ที่ความเข้มข้น 0.5 เท่า และ 1 เท่า (t test, Pr-0.0203 and 0.0054) มีการทำงานของยีน DSCR1 มากเกิดกว่าปกติ ส่วนผลของ siRNA ที่ความเข้มข้น 1.5 เท่าต่อเซลล์ พบว่า ไม่มีความแตกต่างกันในระดับของ mRNA (t test, Pr=0.0627) ถึงแม้ว่า siRNA จะไม่สามารถใช้ยังยั้งการทำงานของยีนในระยะยาวได้ เนื่องจากข้อจำกัดของเซลล์ แต่สามารถทำให้ทราบถึง ผลระยะยาวของ siRNA ต่อการทำงานของยีน DSCR1 ในเซลล์ไฟโบรบลาต์ ในผู้ป่วย ซึ่งอาจเป็นประโยชน์ต่อการศึกษาผลของ siRNA ต่อไปได้